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精子样品制备

发布时间:2018-12-14 22:33| 位朋友查看

简介:精液加等体积室温无菌 Test-Yolk 缓冲液(TYB),用巴氏吸管充分混匀。将装有精液TYB 混合液的尖底离心管冷却至室温,然后静置于 4℃ 冰箱 42h。标本从采集到开……

  用广口杯采集精液,在 37℃ 放置 30min使其液化。再将样品转入 15mL 刻度玻璃管中(Lux,#4106)以测量精液体积,然后进行精液标准分析(详见本书有关章节)。用 50μL 加样器,吸取 5μL 精液置预温的载玻片上,盖上盖玻片后稍等片刻,同时吸取 50μL 精液加0.95mL水(1∶20稀释),在 12mm ×75mm 试管中混匀,再将稀释的精液滴入血细胞计数器上静止片刻,37℃ 条件下,用 400倍相差显微镜观察精子的活动率和前向运动的特性,以评估精子质量。在此不提倡使用电脑辅助精液分析系统(CASA)检测精子浓度和活动率。待血细胞计数板上的精子都沉淀于计数格的同一聚焦面时,即可计数,如同白细胞计数法。最终精子计数乘以活动率% 再乘以精液总量,即得每次标本中总的活精子数。

  精子计数 ×106(精子数 /mL)× 活动率% × 总体积(mL)= 总活精子数 /精液样品

  (二)TYB 添加剂和冷却

  精液加等体积室温无菌 Test-Yolk 缓冲液(TYB),用巴氏吸管充分混匀。将装有精液TYB 混合液的尖底离心管冷却至室温,然后静置于 4℃ 冰箱 42h。标本从采集到开始放入冰箱冷却,不得超过 1h。

  (三)用于精卵孵育的精子准备

  以冷却当天作为第 1天,第 4天晨 8:00,将标本从冰箱中取出。此时可见精子小团沉积于尖底离心管的底部,吸去 TYB 精浆上清液直到液面留约 0.5mL 时,即刻加入 6.0mL37℃ BW W -0.3% HSA 介质,用巴氏吸管吹吸,反复 3次,使缓冲液与精子充分混匀,以上3个步骤要连续快速完成,确保每个样本均在相同温度下(0.5mL 精子,4℃ + 6.0mL 缓冲液,37℃ )震动,此步即为热休克。要想获得最大精子穿卵率,本步骤十分重要。

  完成以上 3个步骤后,将上述试管离心(600× g)10min,弃上清液,再加入 3.0mL BW W -0.3% HSA 介质重新悬浮精子小团,然后将精子悬液平均分成 6管(12mm ×75mm),盖紧,离心(600× g)5h,离心完毕,将试管置 37℃ 持续 60~ 90h,使存活精子上游到上清液中。在此步骤中之所以将样本分成 6管,是为了有效地增加表面积以获得更多的活动精子数。

  用巴氏吸管轻吸每管中的上游精子,并将 6管中的上游精子合并入另一 15mL 的刻度离心管中,用血球计板测定精子浓度。因此时精子浓度低于原先的,所以必需重新稀释计数。将 50μL精子悬液加 200μL水(1∶5稀释),计数方法同前。将最终精子浓度乘以上游精子悬液总体积再除以孵育所要求的浓度,最后得到所要求的体积。

  上游精子总体积(mL)×计数浓度(×106精子数/mL)/5×106精子数/mL=最终体积

  将上游样品离心(600× g)5min 后,立即弃上清液,管内留 0.1mL,然后加入所需体积(根据以上公式求得)的 BW W -0.3% HSA 介质重新混悬,然后在 2 只小培养皿中(35mm ×10mm)各加入 1滴(50μL)悬浮的精子溶液,并覆以 37℃ 的硅油。对于那些精液质量不好的患者来说,选择活动精子是非常有利的,因为选择过程可分离那些不游动精子及干扰测定结果的白细胞及其他细胞的碎片。但选择 100% 活动精子,并不能人为地增加精子获能指数(SCI)结果。如前所述在精子质量正常的个体,其 SPA 已经证实精子上游与总精子数有很好的相关性( r=0.98)。在精卵孵育中(5×106/mL±10% )使用 100% 活动精子,可以准确校正活动精子浓度这点很重要,因为 SCI与活动精子浓度相关性很好,故使用 100% 活动精子可以提高测定的正确性及重复性。

  (四)质量控制:精子标准品的冷冻

  1.冷冻精子标准品的制备方法 分别选择高穿透、低穿透对象的精液标本,其活动精子数应超过 200×106,以含 8% 甘油的等体积 TYB(TYB-G)稀释,然后进行分装,每 0.5mL 注入麦杆中,两端用粘堵剂(critoseal,FisherScientific Co)封住。麦秆平放在 150mm × 15mm 培养皿中。超低温冷冻前,先置于 -20℃ 预冷 10h,再将麦秆快速转移雾化氮气罐中冷冻 30h,然后即可放在液氮中长期保存。采用上述步骤处理后的冷冻精子可保证精子呈悬浮状冷冻而不是沉积于精液底部。

  2.冷冻标准品在 SPA 中的应用 从液氮中取出含有冷冻精子的麦秆,在 4℃ 水浴放置18h,即可使冷冻精子获得最佳恢复及获能状态。采用 250mL 平底组织培养瓶内盛 4℃ 水,浸没麦秆,再将麦秆连同瓶一起放入 4℃ 冰箱中。

  3.冷冻标准品的热休克 麦秆中冷冻的精子标准品于 4℃ 孵育 18h后快速转移到 37℃水浴,3h后取出麦秆,切去一头,把切去的那头浸于内含 6mL 37℃ 缓冲液尖头离心管中。切去麦秆的另一端,使得精子能直接游入缓冲液中。用装有加样器滴头的管子冲洗麦秆,以保证精子全部回收。每次 SPA 测定中都需使用高、低两种不同穿透率的冷冻精子标准品,以监控测定的准确性和精确度,这就是质量控制。

【本文"精子样品制备"的责任编辑:试管婴儿之家】

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